Dr Rąbalski: Jeżeli przestaniemy sekwencjonować, to wirusy mogą wymknąć się spod kontroli

Dodano:
Dr Łukasz Rąbalski w laboratorium Instytutu Biotechnologii UG w Gdańsku Źródło: PAP / Adam Warżawa
Dzięki prowadzeniu monitoringu genetycznego jesteśmy w stanie w porę wyłapać kierunek, w jakim mutują wirusy. Jeżeli przestaniemy sekwencjonować, to może znów być za późno, a wirus się rozprzestrzeni i wymknie spod kontroli – mówi „Wprost” wirusolog dr Łukasz Rąbalski.

Jeszcze w czasie pandemii COVID-19, dr Łukasz Rąbalski z Zakładu Szczepionek Rekombinowanych Międzyuczelnianego Wydziału Biotechnologii Uniwersytetu Gdańskiego i Gdańskiego Uniwersytetu Medycznego uzyskał pełną sekwencję genetyczną koronawirusa SARS-CoV-2 wyizolowanego bezpośrednio od polskiego pacjenta i opublikował ją w globalnej bazie danych GISAID. Dziś mówi „Wprost” o znaczeniu tych wydarzeń, jak również o korzyściach płynących z ciągłego monitoringu genetycznego.

Marek Sławiński, „Wprost”: Panie doktorze, udało się panu rozkodować genom wirusa wywołującego COVID-19, dzięki czemu Polska w dużej mierze przyczyniła się do walki z pandemią. Czy można w prostych słowach wytłumaczyć, jak uzyskał pan pełną sekwencję genetyczną koronawirusa SARS-CoV-2?

Dr Łukasz Rąbalski: Naszą pierwszą sekwencją była ta z 20 kwietnia 2020 roku. To była Wielkanoc i pamiętam jak dziś, że spędzałem wieczory w laboratorium, usilnie próbując ją odkodować. Już w lutym pojawiły się protokoły mówiące o tym, jak można to zrobić szybciej i łatwiej, co starałem się zastosować w naszym laboratorium na Międzyuczelnianym Wydziale Biotechnologii UG i GUMed.

To był gorący okres, kiedy każdy pracował w trybie „wszystkie ręce na pokład”, więc i ja postanowiłem działać. Jestem wirusologiem molekularnym, specjalizuję się w biologii molekularnej wirusów i diagnostyce, więc zadanie to pasowało do mojego profilu naukowego. Uniwersytet Gdański został wówczas oficjalnie poproszony o pomoc w organizacji laboratoriów diagnostycznych. Zdecydowaliśmy się to zrobić i wraz z jedną z firm diagnostycznych zorganizowaliśmy laboratorium w 7 Szpitalu Marynarki Wojennej w Gdańsku, gdzie uzyskaliśmy materiał bezpośrednio od pacjenta, a następnie poddaliśmy go analizie. To misja niebywałej wagi, szczególnie gdy przypominamy sobie, jak wyglądał świat w dobie pandemii.

Jakie były największe wyzwania podczas sekwencjonowania genetycznego koronawirusa SARS-CoV-2 od polskiego pacjenta? Czy początkowo napotkał pan jakieś trudności?

Początkowo występowały trudności z pozyskaniem materiału. Zależało mi na porozumieniu z innymi laboratoriami prowadzącymi diagnostykę, co było dość skomplikowane. Nie chciano dopuszczać nas, naukowców. Uważano, że jesteśmy ludźmi z zewnątrz. To się oczywiście zmieniło z biegiem czasu. Później jednak tak naprawdę ta współpraca była niemal idealna – czy to z Sanepidem, czy z innymi laboratoriami prywatnymi. Mam obecnie na koncie ponad 18 tysięcy sekwencji SARS-CoV-2, które opublikowaliśmy w międzynarodowej bazie danych GISAID. Źródła materiału genetycznego były przeróżne, z całej Polski.

Mówi pan o 18 tysiącach sekwencji. Dlaczego robi się ich tak wiele?

Robi się ich zdecydowanie więcej. To był pierwszy przypadek, kiedy naukowcy na całym świecie mogli śledzić epidemię pod kątem molekularnym, czyli na tym najniższym poziomie badawczym. Mogliśmy to obserwować w czasie rzeczywistym. To jest niesamowite. Dzięki temu zostały wykryte dość wcześnie różne warianty genetyczne.

Następnie, po powiązaniu zmienności genetycznej z postacią choroby wnioskowano, co będzie dalej, w jakim kierunku to będzie postępowało. Początkowo twierdzono, że wirus SARS-CoV-2 będzie wirusem sezonowym, jak grypa. Teraz widzimy, że to nie ma w ogóle żadnej korelacji.

Monitoring genetyczny pozwala nam też na sprawdzenie, czy szczepionki, które mamy będą dalej działać. Dzięki obserwacji zmienności genetycznej możemy wnioskować o tym, kiedy i jaką zastosować szczepionkę. Oczywiście wciąż trzeba wykonać serię badań w laboratorium. Od tego nie uciekniemy. Nie da się zrobić tego in silico (za pomocą komputera – red.), nawet przy wykorzystaniu sztucznej inteligencji.

Pierwszym krokiem pozostaje jednak monitoring genetyczny, który umożliwia nam rozpoznanie nowych wariantów. Wraz z profesorem Krzysztofem Pyrciem z Małopolskiego Centrum Biotechnologii Uniwersytetu Jagiellońskiego znaleźliśmy bardzo specyficzny wariant genetyczny posiadający dużą delecję (utratę fragmentu materiału genetycznego – red.). Genom wirusa był pozbawiony całkiem sporego fragmentu dotyczącego dwóch genów. My byliśmy bardzo ciekawi, co się dalej będzie działo. Tak duża delecja jest wyjątkowo rzadko obserwowana. Ona jednak naturalnie wygasła. Okazało się, że tak zmieniony wirus nie był w stanie konkurować z innymi wariantami genetycznymi. Ważna pod względem epidemicznym jest kontrola tej zmienności genetycznej w kontekście poszukiwania, gdzie był tzw. „pacjent zero” i gdzie dana infekcja się rozpoczęła.

Tutaj warto wspomnieć o naszym badaniu nad norkami, gdzie też wykazaliśmy obecność wirusa na jednej z ferm. Po kilku miesiącach zebrano próbki z tej samej fermy i okazało się, że wirus zmutował tam na miejscu. Czyli stało się coś, czego się wszyscy najbardziej obawiali. Wcześniejsze badania nad wirusem grypy pokazywały, że w takich warunkach stawał się on bardziej zjadliwy, czyli groźniejszy również dla ludzi. Baliśmy się tego, że analogicznie do wirusa grypy w sytuacji, kiedy wirus SARS-CoV-2 będzie wielokrotnie się namnażać w populacji norek, może dojść do pojawienia się nowego wariantu genetycznego, który będzie groźny dla człowieka. Dlatego też wprowadzono bardzo duży nadzór nad fermami norek w całej Europie.

Czyli można powiedzieć, że za sprawą monitoringu genetycznego niejako prognozuje się, w jakim kierunku ten wirus może się zmieniać genetycznie w przyszłości, żeby odpowiednio wcześnie przygotować szczepionki?

Zmienność genetyczną można luźno podzielić na dwa typy – kierunkową i niekierunkową. Ta druga to przypadkowe mutacje, które pojawiają się regularnie. Jeżeli mamy wirusy RNA – grypa, SARS-CoV-2, to są to mutacje bardzo częste. W przypadku wirusów DNA mutacje występują dużo rzadziej. Mutacje mogą dawać nowe cechy fenotypowe, czyli takie cechy, które można zaobserwować. Presja ewolucyjna polega na wybieraniu tych mutacji, które są pożyteczne, pozytywne dla wirusa, a te negatywne zanikają, ponieważ są wypierane przez inne warianty genetyczne lub też powodują tak dużą zmianę w genomie wirusa, że nie jest on w stanie namnażać się dalej.

Ta zmienność zależy od typu gospodarza. Inaczej będzie mutował wirus wśród populacji ludzkiej, a inaczej będzie mutować wśród populacji norek. My staramy się to przewidywać. To ma znaczenie między innymi w kontekście leków. One są projektowane, by zakłócić możliwość wirusa do namnażania się. Więc jeżeli będziemy celowali lekami w funkcjonalność tego genomu, to będziemy mieli wysokie prawdopodobieństwo, że lek będzie działał dłużej albo będzie działał lepiej na większy zakres wariantów genetycznych.

Jak wygląda rozkodowanie genomu wirusa? Co widać albo czego nie widać? Jak to się robi w praktyce?

Najpierw pobieramy próbkę. Zazwyczaj jest to wymaz z nosa czy z gardła. Następnie zależy nam na zabezpieczeniu materiału, więc na początku pobierano próbki na typowe bufory czy też na sól fizjologiczną, ale wiązało się to z dużym zagrożeniem dla osoby, która pracowała na tym materiale.

W późniejszym okresie wprowadzono bufory inaktywujące, które zabijały wirusa. Dzięki nim próbka stawała się całkowicie bezpieczna, a z drugiej strony materiał genetyczny wirusa był zabezpieczony przed rozpadem. I to było duże ułatwienie dla takich osób jak ja, czy innych prowadzących monitoring genetyczny, bo dzięki temu próbkę można było w relatywnie długim czasie dostarczać do laboratorium i nie trzeba było jej zamrażać. Drugi poziom to izolacja materiału genetycznego, którą zajmują się obecnie głównie maszyny. Polega na tym, by wyciągnąć ten materiał genetyczny z tej mieszaniny dezaktywującej.

Następnie RNA przepisuje się na DNA w tzw. reakcji odwrotnej transkrypcji, gdzie otrzymujemy z cząsteczki RNA, która jest materiałem genetycznym wirusa, cząsteczkę DNA, którą dużo łatwiej manipulować ze względu na to, że jest mniej podatna na uszkodzenia.

Problem polegał jednak na tym, że materiał genetyczny wirusa w porównaniu do materiału gospodarza jest w mniejszości. Jedną z metod poradzenia sobie z tym było zastosowanie wysokoprzepustowego sekwencjonowania nowej generacji. Jednak zdecydowanie tańszą metodą na uzyskanie wartościowych wyników jest powielenie DNA metodą reakcji PCR (łańcuchowa reakcja polimerazy – red.).

Po tej procedurze uzyskujemy bardzo dużą ilość materiału genetycznego DNA wirusa, który możemy sekwencjonować. Następnie przygotowujemy sobie tak zwaną bibliotekę do sekwencjonowania za pośrednictwem odpowiednich reakcji enzymatycznych i biochemicznych. Dodajemy znaczniki, po czym przenosimy ją do sekwenatora. My korzystaliśmy z technologii nanoporów firmy Oxford Nanopore Technology, ale również wykorzystywaliśmy technologię firmy Ilumina.

A czym właściwie jest to sekwencjonowanie?

To metoda odczytywania kolejności par nukleotydów w cząsteczce DNA. Mamy materiał genetyczny, który jest w postaci DNA i składa się z zasad, które trzeba następnie przetłumaczyć na język komputera, gdzie mamy zapis ACTG (A – adenina, C – cytozyna, T – tymina, G – guanina).

Na końcu otrzymujemy sekwencję, czyli tak naprawdę zapis czteroliterowy. Sekwencjonowanie w tym przypadku nie polega na jednokrotnym odczytaniu genomu. Podzieliliśmy bowiem wcześniej ten genom na fragmenty, więc każdy z tych fragmentów jest wielokrotnie sekwencjonowany. Z tych wielokrotnych odczytów otrzymujemy sekwencję wynikową, czyli sekwencję odpowiadającą sekwencji biologicznej.

Jakie znaczenie ma opublikowanie sekwencji genetycznej w globalnej bazie danych GISAID dla dalszych badań i walki z pandemią i innych pandemii?

Jeżeli chodzi o SARS-CoV-2, to miejmy nadzieję, że już do nas nie wróci na takim poziomie, dzięki temu, że mamy szczepionki. A mamy je dzięki temu, że udało nam się rozkodować ten cały materiał genetyczny i pokazać co jest w nim ważne. W tym momencie nowoczesne szczepionki opierają się tylko na fragmentach poszczególnych patogenów. Dzięki temu możliwe było wprowadzenia ich kolejnych generacji.

Po drugie, jeżeli pojawi się nowy wariant, który okaże się groźniejszy dla ludzi, to będziemy widzieli, że znów coś niepokojąco się dzieje. Jednak dzięki prowadzeniu monitoringu, będziemy w stanie to w porę wyłapać. Jeżeli przestaniemy sekwencjonować, to może znów być za późno, a wirus się rozprzestrzeni i wymknie spod kontroli.

Projekt współfinansowany ze środków Ministerstwa Edukacji i Nauki w ramach programu „Społeczna Odpowiedzialność Nauki”

Źródło: WPROST.pl
Proszę czekać ...

Proszę czekać ...

Proszę czekać ...

Proszę czekać ...